Introducción a la técnica de ELISA

Fuente: Internet

ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.

Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:

-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo. -En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña. -En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.

 En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra.

Principios de la técnica de ELISA

Aquí se muestra un ppt sobre los principios de la técncia de ELISA para su revisión para la clase práctica

Elisa from LABIMUNO UFBA

Video de la técnica de ELISA

A continuación se muestra un video demostrativo de la técnica de ELISA para su aplicación en la clase práctica N° 3 del curso.

Introducción a Western Blot

Imagen tomada de Internet

El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.1 2 Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia entre otros métodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas. Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de proteínas diferentes.3 4 El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford.2 El nombre (Western, occidental en inglés) le fue dado por W. Neal Burnette,5 y consiste en un juego de palabras con una técnica análoga pero que usa DNA, el Southern (sureño) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras técnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot.

A continuación la presentación utilizada es la primera sesión de clases 16/07, revísela y estudie para la evaluación oral de la sesión 2.

PPT sobre principios de WBlot

Aquí se muestra un ppt sobre la técnica de Western Blot para el repaso de los principios y bases teóricas de la técnica.

Western blotting from Akhil Chinnabathini

Video de la técnica de Western Blot

A continuación se muestra un video introductorio de como realizar correctamente la técnica de Western Blot para su realización en la clase práctica N° 2 de Inmunología.